lncRNA研究方案

　　汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

　　lncRNA研究技术手册

　　一、lncRNA概述

　　lncRNA(LongnoncodingRNAs,lncRNAs)长链非编码RNA，起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“”，是RNA聚合酶II转录的副产物。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，以及染色质修饰，，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。随着研究的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究将是RNA基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。

　　lncRNA的功能分为3方面：

　　1）通过修饰染色体参与表观调节-与mRNA相互作用；

　　2）通过与转录因子的相互作用参与转录调节-与蛋白（转录因子）相互作用；

　　3）通过影响mRNA处理过程参与转录后调节-ceRNA作用模式。

　　三种lncRNA机制作用方式，1和2主要发生于细胞核，3则发生在胞质。从研究难度来说，13：1）的RNAinteraction与array并无成熟的研究模式；2）需要RIP和RNApull-down，实验执行难度大风险高；3）转录后调节的研究方法-ceRNA作用模式可行性及阳性率较高，是目前研究最热门的lncRNA作用方式。

　　lncRNA的ceRNA作用模式：lncRNA作为竞争性内源RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)，与microRNA结合，在细胞中起到microRNA海绵的作用。从而降低microRNA的活性，间接上调microRNA

　　相关靶基因的表达。

　　图：lncRNA的ceRNA作用模式

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　　汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

　　二、汉恒生物-lncRNA研究专家

　　汉恒生物lncRNA研究团队，为您提供基于ceRNA调控机制的lncRNA系统研究方案。大致流程如下：

　　1）验证lncRNA的表达水平和细胞内亚定位；

　　2）通过网络数据库，预测lncRNA可能结合的miRNAs；

　　3）lncRNA结合的miRNAs的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证；

　　4）miRNA靶基因预测与功能富集分析；

　　5）miRNA靶基因的筛选、验证及相关功能研究；

　　6）lncRNA-miRNA-mRNA

　　调控网络的验证。

　　图2汉恒生物lncRNA研究流程示意图

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　　汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

　　三、汉恒生物-lncRNA研究实例

　　四、研究步骤解析：

　　1、验证lncRNA的表达水平和细胞内亚定位：

　　汉恒生物拥有成熟的lncRNA-qPCR验证技术，可验证HOTAIR在不同样本中的表达差异性（如肺癌组织和癌旁组织样本），本例中，HOTAIR在癌组织中的表达量高于癌旁组织。qPCR筛选HOTAIR内源表达丰度高的肺癌细胞系用于后续细胞功能学实验。由于

　　lncRNA-miRNA-mRNA调控机制的前提是

　　lncRNA在细胞质表达，汉恒生物提供的核质分离和qPCR技术，可确定HOTAIR是否在细胞质中表达。

　　2、通过网络数据库，预测HOTAIR可能结合的miRNAs：

　　3、lncRNA结合的miRNAs的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证：

　　将HOTAIR序列克隆构建至报告基因载体psiCHECK，合成上述预测到的miRNAmimics及对照，在293T细胞内同时转染miRNAmimics和psiCHECK-HOTAIR，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，并筛选报告基因表达下调的miRNAs（可能有多个，本例中假定选择hsa-miR-17-5p进行后续研究）。

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　　汉恒生物科技(上海)有限公司地址：上海市浦东新区蔡伦路150号1号楼2楼

　　汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

　　4、miRNA靶基因预测与功能富集分析：对hsa-miR-17-5p

　　进行靶基因预测，结果如下：

　　通过功能富集分析将肺癌相关的基因筛选出来：

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　　5、miRNA靶基因的筛选、验证及相关功能研究：

　　（1）初筛：qPCR验证靶基因在癌组织和癌旁组织中的表达量差异，筛选与lncRNA表达呈正相关的靶基因（本例选择在癌组织中高表达的靶基因）；

　　（2）进一步筛选：在肺癌细胞系中下调HOTAIR表达（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），qPCR验证上述靶基因表达水平。选择HOTAIR干扰后，表达量也明显下调的靶基因作为研究对象，本例中假定为CDK6基因。查询CDK6的功能，发现它主要与细胞周期相关。

　　（3）在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），WB和qPCR检测CDK6的表达水平；

　　（4）在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），通过细胞周期和细胞增殖等实验，确定hsa-miR-17-5p对细胞功能的影响；

　　（5）双荧光素酶报告基因实验：构建CDK63’UTR报告基因载体，将hsa-miR-17-5pmimics与报告基因载体共转293T工具细胞，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，阐明hsa-miR-17-5p作用于CDK6的分子机制；

　　注：为了实验的严谨性，可加入CDK63’UTR区hsa-miR-17-5p预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

　　6、肺癌细胞系中干扰HOTAIR，检测CDK6表达水平及细胞功能学研究：

　　在肺癌细胞系中干扰HOTAIR（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），然后分别进行如下实验：

　　1）WB和qPCR检测CDK6表达水平；

　　2）qPCR检测hsa-miR-17-5p表达水平；

　　3）细胞周期和细胞增殖等实验，研究HOTAIR对细胞功能的影响；

　　7、lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的验证：

　　汉恒生物-lncRNA-miRNA-mRNA调控机制研究解决方案：基于ceRNA作用方式和双荧光素酶报告基因实验，证明lncRNA可rescue下游miRNA对其靶基因的抑制作用。

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　　本实例的具体流程如下：

　　（1）构建HOTAIR报告基因载体，将它和hsa-miR-17-5pmimics共转至293T工具细胞中，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，直接证明HOTAIR对hsa-miR-17-5p的海绵吸附机制；

　　（2）使用步骤5（5）中构建的CDK63’UTR报告基因载体，并构建HOTAIR过表达载体，将两者共转至293T工具细胞中，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，可间接证明HOTAIR通过海绵吸附hsa-miR-17-5p，从而上调CDK6靶基因的表达。

　　注：为了实验的严谨性，上述双荧光素酶实验可分别加入HOTAIR序列或CDK63’UTR区hsa-miR-17-5p预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

　　五、参考文献：

　　1、LongnoncodingRNAs:functionalsurprisesfromtheRNAworld.WiluszJE,SunwooH,SpectorDL.GenesDev.2009Jul1;23(13):1494-504.

　　2、AlongnoncodingRNAcontrolsmuscledifferentiationbyfunctioningasacompetingendogenousRNA.CesanaM,CacchiarelliD,LegniniI,SantiniT,SthandierO,ChinappiM,TramontanoA,BozzoniI.2011Oct14;147(2):358-69.

　　3、ThelongnoncodingRNACASC2functionsasacompetingendogenousRNAbyspongingmiR-18aincolorectalcancer.HuangG,WuX,LiS,XuX,ZhuH,ChenX.2016May20;6:26524.

　　4、LongnoncodingRNABC032469,anovelcompetingendogenousRNA,upregulateshTERTexpressionbyspongingmiR-1207-5pandpromotesproliferationingastriccancer.LMH,TangB,ZengS,HuCJ,XieR,WuYY,WangSM,HeFT,YangSM.Oncogene.2016Jul7;35(27):3524-34.

　　5、LncRNAHOTAIRfunctionsasacompetingendogenousRNAtoregulateHER2expressionbyspongingmiR-331-3pingastriccancer.LiuXH,SunM,NieFQ,GeYB,ZhangEB,YinDD,KongR,XiaR,LuKH,LiJH,DeW,WangKM,WangZX.MolCancer.2014Apr28;13:92.

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